助力大规模并行测序研究，这家IVD原料公司干了些什么！

    高通量测序技术（High-throughputsequencing）又称“下一代”测序技术（"Next-generation"sequencingtechnology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。其中，基于大规模并行测序（massivelyparallelsequencing，简写MPS）的DNA测序技术能够在DNA纳米阵列上以相对较低的成本提供数十亿次读取，并能实现多种基因组应用。同时，通过进一步提高MPS测序的读取长度、序列质量和降低成本将使更经济实惠和准确的全面健康监测测试成为可能。

    目前，MPS测序主要使用染料标记的可逆终止核苷酸（dye-labeledreversibly terminatednucleotides，RTs），但是这些核苷酸（RTs）存在着以下一些缺点：合成成本高、结合效率低、每个碱基仅限定一种染料使产生的信号有限、以及会造成天然核苷酸的不完全再生（即在染料剪切后，染料连接物的一部分作为“疤痕”残留在碱基上）。因此，华大基因（BGI）及其在美国硅谷的子公司CompleteGenomicsIncorporated（CGI）开发了一种新颖的、更高效和准确的MPS测序方法，称为：COOLMPS™（图一）[1]。

图一

    COOLMPS™测序的概念于2016年由CGI提出，并申请了专利。其基本原理是在测序过程的每一个循环中，利用特异性识别单个核苷酸的荧光标记抗体和3’端的天然核苷酸结合，阻断DNA链的延伸并通过读取不同的荧光信号，辨别不同的3’末端碱基类型；然后通过条件的改变，使结合在3’末端核苷酸上的荧光标记抗体解离下来，让天然核苷酸获得再生，并在碱基上不留有“疤痕“，从而在新的测序循环中可以得到进一步延伸，而不受前一个循环的干扰（如图二）。这种方法的优点在于：未标记的天然核苷酸更容易制备，成本更加低廉，并且因为在延伸过程中不产生“化学疤痕”，使其能够更高效的和下一个核苷酸碱基整合；此外，因为针对单个核苷酸的特异性抗体上，可以标记多个染料分子（如2-5个），和荧光标记的核苷酸相比，能够大大增强测序信号。

    图二

    由此可见，为了使COOLMPS™平台能够商业化并被广泛应用，针对单个核苷酸的、高特异性的单克隆抗体是关键。CGI自2017年开始即和优睿赛思（Yurogen Biosystems）合作，致力于开发针对单个核苷酸的兔单克隆抗体；到2021年底为止，已经成功的为CGI前后开发了三代针对于单个核苷酸的高特异性兔单克隆抗体，最终定株的抗体通过大规模重组表达生产，成功应用于CGI和华大基因推出的新一代基于COOLMPS™的NGS测序试剂盒[2,3]。

    下面以dATP为例来分享对于单核苷酸单克隆抗体的开发经验。毫无疑问，针对单核苷酸类半抗原（Hapten），需要将其偶联到KLH、BSA等carrier蛋白上进行免疫（图三）；其免疫周期相对于一般的蛋白免疫也要长。相对于小鼠等啮齿类动物，兔子独特的免疫系统对半抗原有更好的免疫应答，经过9周左右的免疫周期，便获得针对dATP较理想的滴度（图三）。为了更加准确的评价血清有效抗体的滴度，优睿赛思合成了用生物素（biotin）长臂（PEG）偶联的dATP，结合亲和素（streptavidin）预处理的96孔板来进行滴度检测，结果显示：在多抗血清阶段，经KLH-dATP免疫的兔血清，对于dCTP、dGTP、dTTP仍旧存在着一定的交叉反应。

    图三

    基于此，为了获得高亲和力以及高特异性的dATP兔单克隆抗体，首先，优睿团队对兔子进行一次KLH-dATP加免，收集脾脏细胞进行单B细胞分选后同时利用生物素标记的dATP对兔子脾脏细胞进行抗原特异性B细胞富集并加入了大量无生物素标记的dCTP、dTTP、dGTP进行封闭；然后，对分选的抗原特异性B细胞进行体外培养，一周后取上清针对生物素偶联的dATP进行高通量的ELISA筛选，同时针对生物素偶联的dCTP、dTTP和dGTP进行负筛选。经过这个流程，在免疫完成后两周之内即获得了58株特异性结合dATP的阳性克隆（图四）。

    最后，CGI根据这些阳性克隆针对dATP的ELISA读数，以及dCTP、dTTP和dGTP的交叉反应率，从中选取了8株阳性克隆进行基因克隆并重组表达，四周之后即获得了超过1mg的重组兔抗dATP单克隆抗体；经优睿生物通过ELISA初步验证之后，特异性与B细胞上清阶段的筛选基本一致。CGI将交付的重组单克隆抗体荧光标记之后，在COOLMPS™上进行最终的质检测试，并选取表现最佳的2株重组兔单克隆抗体（图四），作为新型NGS测试试剂盒的重要组成成分。

    图四

    综上所述，利用兔子作为宿主动物，结合优睿赛思的SMab®单细胞筛选平台，在开发针对小分子抗原的高特异性兔单克隆抗体上，具有巨大的优势：

    1.经研究表明，动物的免疫系统对小分子半抗原（包括多糖类、化合物、核苷酸和翻译后修饰等），并不是通过经典的MHCI和MHCII途径进行抗原呈递，而是通过CD1分子；兔子拥有四种CD1亚家族蛋白，而啮齿类动物（如小鼠）一般只具备两种（图五）[4]，从而使兔子对于小分子抗原的呈递效率大大提高，增强对其的免疫反应。

    图五

    2.SMab®平台主要通过抗原特异性富集来筛选B淋巴细胞，使得筛选后细胞的阳性率大大提高；同时，还可以通过在富集阶段，进行负筛选、阻断等方法来去除非特异性结合的B淋巴细胞，来提高获得特异性B细胞克隆的几率。

    3.SMab®平台的核心是对单个B淋巴细胞进行体外培养，上清中表达高达10 ug/mL的兔IgG保证各种筛选正常进行，包括基于ELISA方法的负筛选、竞争ELISA、阻断ELISA等，以及流式细胞分析、Western Blot分析等；通过这些分析，可以在非常早期就可以锁定特异性阳性克隆，大大减少后期克隆、表达和验证的工作量。如果通过常规的单B细胞筛选和克隆的方法，需要将多达几百个从单B细胞中获取的抗体基因，再在体外进行重组表达验证，而最终可能也就获得几株所需要的高特异性抗体，但所涉及的工作量、交付时间和费用等都将大大增加。

    优睿赛思自2015年成立起，已为国内外知名企业交付了多达几百个高度定制的、针对小分子半抗原的兔单克隆抗体定制项目，针对靶点包括（不限于）：翻译后修饰（磷酸化、甲基化）、小分子化合物（包括极低免疫原性的聚二乙醇，PEG）、单个核苷酸、mRNA、siRNA以及多糖（Glycan）等。

    近年来，抗体偶联药物（antibodydrug conjugates, ADCs）在国内外市场日益趋热，针对ADC上细胞毒性分子（playload，往往是小分子）的高特异性单克隆抗体，是每一款ADC药物在临床试验中进行药物动力学(pK)检测所必须的。着眼未来，面向全球市场优睿赛思将携手国内外合作伙伴共同深耕更多First-in-Class和Best-in-Class的抗体，为人类生命健康做出更多贡献。